皂苷是一类高度多样的甾体和三萜苷类天然产物，具有广泛的生物活性，在医药、食品和化妆品等领域应用广泛。糖基化修饰是决定皂苷结构复杂性、化学稳定性、水溶性和生物活性等的重要因素，但目前甾体多糖苷的糖链生物合成还不清楚。重楼为珍稀名贵中药，是100多种中成药和中药方剂的重要原料药，药材需求量大。甾体皂苷（又名重楼皂苷）是重楼主要活性成分，具有广泛的药理活性，但由于重楼资源匮乏、生长缓慢，皂苷分离制备过程繁琐、化学合成困难等，严重限制了重楼皂苷的深入药理研究与开发，而合成生物学和酶催化技术可提供新的解决方案。

　　中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，黎胜红研究员带领的植物活性天然产物发现与生物合成专题组聚焦于重楼皂苷的生物合成研究，取得了重要突破。专题组从滇重楼中鉴定了参与重楼皂苷生物合成的系列UDP-糖基转移酶，实现了重楼稀有皂苷合成途径的解析，并发现重楼皂苷对四种广泛传播的人类致病真菌具有显著抑制作用，初步揭示了其抗真菌作用机制。黎胜红专题组通过转录组测序、酶促反应、现代波谱技术等，阐明了合成重楼皂苷的6个UDP-糖基转移酶（UGT），其中PpUGT1和2（UGT80A40和UGT80A41）能够催化薯蓣皂苷元（1）和偏诺皂苷元（2）分别生成延龄草苷（3）和偏诺皂苷元-3-O-葡萄糖苷（4）；PpUGT3（UGT73CE1）进一步催化3和4的2′-O-鼠李糖基化反应，分别生成重楼皂苷V（5）和重楼皂苷VI（6）；PpUGT 4-6（UGT91AH 1-3）再进一步催化5和6的6′-O-葡萄糖基化反应，分别生成薯蓣皂苷元-3-O-鼠李糖基-(1→2)-[葡萄糖基-(1→6)]-葡萄糖苷（13）和trikamsesuquiside B（14）（图1A）。基因表达模式和化合物定量分析表明，UGT91AH 1-3、UGT73CE1以及UGT80A40编码基因主要在重楼根状茎和须根中表达，化合物14、重楼皂苷I和II也主要在这些组织中积累。有趣的是，化合物13和14此前尚未在重楼属植物中分离得到。本研究通过UGT克隆和功能鉴定，实现了重楼中微量稀有重楼皂苷成分的发现与生物合成。 

　　在此基础上，底物选择性研究发现，UGT80A40和UGT80A41表现出葡萄糖供体特异性和糖受体高度杂泛性；UGT73CE1表现出鼠李糖转移酶特异性和糖受体杂泛性；UGT91AH 1-3表现出糖受体和供体高度杂泛性。利用6个UGT的底物杂泛性获得24个萜类糖苷化合物，包括15个新化合物以及1个稀有人参皂苷。进一步通过分子对接和定点突变技术研究了PpUGT的催化机制，构建了44个突变酶，发现糖基受体周围的芳香族氨基酸残基通过与底物形成氢键或π堆积，在底物识别和稳定中发挥重要作用。其中，突变酶UGT91AH1^Y187A以化合物6为底物时，糖基化酶活性增加，转化率为野生型酶的1.3倍；以化合物15为底物时，UGT91AH1^Y187A合成23a的转化率为野生型酶的2.8倍，同时23b的合成明显减少（图1B），为UGT改造奠定了重要基础。 

图1A 重楼UGT催化的甾体皂苷糖基化级联反应; 图1B UGT91AH 1-3突变酶转化率。 

　　活性研究发现，化合物S1、13、纤细薯蓣皂苷（gracillin）以及重楼皂苷I、II、V、VI、VII和H对3种皮肤癣菌（红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、石膏小孢子菌）以及耐氟康唑白色念珠菌均表现出显著抑制活性。其中，重楼皂苷I和II对红色毛癣菌的抑制活性比阳性药物盐酸特比萘芬分别强12倍和4倍，MIC₅₀ 值分别为0.12 ± 0.02 μM和0.37 ± 0.01 μM。初步构效关系分析发现，C-2′位鼠李糖侧链对该类化合物的抗真菌活性具有重要贡献，此外，三糖苷化合物13的抗真菌活性明显强于其二糖前体重楼皂苷V。初步作用机制研究表明，重楼皂苷主要作用于红色毛癣菌的细胞膜，可能通过麦角甾醇依赖的方式影响膜的完整性和通透性，从而影响跨膜转运来发挥抑菌作用（图2），为重楼皂苷作为抗真菌药物研发奠定了重要基础。 

　　以上研究成果以Unraveling the serial glycosylation in the biosynthesis of steroidalsaponins in the medicinal plant Paris polyphylla and their antifungal action为题，发表在《药学学报》英文刊APSB上。黎胜红专题组的陈月桂博士研究生和严沁硕士研究生为本论文的共同第一作者，黎胜红研究员和成都中医药大学刘燕教授为通讯作者，纪运恒研究员为论文共同作者。以上研究工作得到了国家自然科学基金、云南省重点研发计划生物医药重大专项等项目资助。 

　　文章链接

图2 化合物13和重楼皂苷I对红色毛癣菌的抑菌作用